甾体6位取代基朝向的判断方法总结以及丙酸酯氟替卡松EP杂质K的6位氯的朝向判断

甾体药物简介

甾体化合物是一类具有多种生理活性的小分子化学物质，具有抗癌，抗炎，抗过敏和肌肉松弛等生物活性。天然的甾体化合物也大量存在于自然界中，比如羊毛脂，植物甾醇、胆汁酸、C21甾类、昆虫变态激素、强心苷、甾体皂苷、甾体生物碱等。因为它们生物活性的多样性和在自然界中的普遍性，人类很早（如18世纪中后期）就对这类化合物有零星的、非系统的观察和分离记录，这是漫长的科学发现的序曲。而对甾体化合物的系统性、基于现代化学的科学研究，大致始于19世纪早期至20世纪初。下图显示的是甾体化合物研究的一个大致的历史进程。

图1. 甾体化合物科学研究关键里程碑

相对于其他类型化合物的研究来说，比如叶酸类，氨基酸类等，甾体化学的研究是比较早的。因此，我们现在可以看到甾体相关的研究报道都基本集中于上世纪中期（20世纪30-60年代）。对甾体化合物基本碳骨架结构的阐明，对其结构的化学改造和相应生物活性的研究，以及甾体药物逐渐大规模地应用于人类的疾病治疗，都在此过程中不断发展和完善

图2. 甾体药物的应用历史

时至今日，甾体药物已经是全球第二大类化学药物（图2. 甾体药物的应用历史），仅次于抗生素。全球已开发生产的甾体类药物总数，在2021年的数据是 超过400种，而更早的2019年报告数据为超过300种（图3. 几种具有代表性的甾体激素类药物）。这显示了该类药物的持续研发和增长趋势。

图3. 几种重要的甾体激素类药物

甾体药物的杂质研究

作为一大类关键药物，甾体药物的质量控制自然是当今药物研发和生产中非常重要的组成部分。而甾体药物的相关杂质研究又是质量控制中相当核心的部分。多年来，思科（深圳）药物研发有限公司对甾体药物杂质的研究也是不遗余力的，目前在库已经有近十种甾体药物的近百种杂质分子。甾体药物的结构（见下图甾核的碳骨架结构通式和编号）和常规的化合物区别较大，因此有关它的化学也很有特点，自成一体。在对其核心结构进行结构修饰的时候，取代基的连接和方向选择性是该类化合物化学研究的要点。也正是因为选择性问题的存在，甾体药物的合成过程中会发生很多副反应，生成很多相应的杂质分子。

图4. 甾核的碳骨架结构和编号

这里我们将重点介绍一类甾体杂质，即甾体6-位取代基杂质，讨论一下该位点的取代基的朝向是如何判断的。对这个问题的认知也非常有助于掌握甾体相关化学的特点，减少对结构的误判，提高药物杂质合成的准确性，从而避免影响客户相关课题的研发和申报。

从结构通式中，我们看到甾体的6位处于甾体的A环/B环的连接处。在没有取代基的时候，这个位点是个亚甲基。而当有取代基引入到这个位点的时候，取代基可能有两种连接方式：一是朝上，即β朝向，处于ABCD环形成的平面上方；或者是朝下，即α朝向，此时处于ABCD环平面的下方。这样我们就能理解，正是因为18位和19位的甲基都处在环平面的上方，上方的基团空间阻碍较大，所以很多甾体的反应优先发生在环平面下方，即生成α取代产物为主了。

甾体6位取代基朝向判断的一些文献报道

对于在6位引入基团朝向的判断，前人已经做了许多相关的研究。总的来说，化学家综合利用反应的核磁共振（NMR）耦合常数分析、立体选择性、2D-NMR中的NOE等多种关键技术来进行立体化学的确证。

下面对四篇相关文献判断6位取代基朝向情况做了较为详细的总结和对比：

文献一：基于耦合常数与NOE的NMR构象分析（用于合成硝基甾体）

图5. 2,2,6β-Trinitrocholest-4-en-3-one

Katoch和同事对目标化合物3（i.e., 2,2,6β-Trinitrocholest-4-en-3-one，图5）的6位硝基的β朝向是这样判断的。他们综合了1D与2D NMR谱图解析，核心是耦合常数分析和NOE效应，认为该硝基是β朝向的。核心依据如下：

1. H-6α信号：H-6α出现在δ 4.94 ppm (dd)，其与H-7α、H-7β的耦合常数（J ~4.8 Hz，J ~1.7 Hz）符合6α质子（NO?在β位）与邻位质子的典型耦合模式（依据Karplus equation推算）。

2. C-10甲基屏蔽效应：C-10甲基（δ1.02 ppm）与未取代底物相比被显著屏蔽（向高场移动0.16 ppm）。这表明该甲基位于6β-硝基的磁各向异性屏蔽锥内，是硝基处于β位的直接证据。

3. NOE空间相关：NOESY谱中观察到H-4与H-6α的相关性，且H-4为单峰。若硝基在α位，H-4应与H-5存在远程耦合而显示为双峰，且H-6β会显示不同的裂分模式（文章引用文献说是八重峰）。此现象支持硝基为β位。

该文的判断逻辑：通过耦合常数模式、远程屏蔽效应和NOE空间接近性三者相互印证，确证6位取代基为β-硝基。这是一种经典的、基于NMR数据的“解谱”式构型确定方法。

Ref：Rita Katoch, R. Sridharan and Girish K. Trivedi. Characterization and Conformational Studies of a Novel Trinitro Steroid using 2D-NMR. J. Indian Chem. Soc., Vol. 75, October-December 1998, pp. 543-547.

文献二: 基于耦合常数变化的构象效应分析（用于构象研究）

图6. 4-烯-3-酮甾体

Marat等对一系列4-烯-3-酮甾体，其6位为6α-取代基（甲基、氯、氟）进行了分析（图6）。本文并非直接“判断”这些已知合成化合物的6位构型，而是以已知的6α-取代为前提，研究其对A环构象的远程影响。他们通过监测A环质子（H-1α, H-1β, H-2α, H-2β）间关键耦合常数3J(1α,2β)和3J(1β,2α)的变化来推断6α取代引起的构象扰动。核心依据是与未取代的对照物相比，6α取代的甾体中，3J(1α,2β)减小，3J(1β,2α)增大。这表明A环中“倒置”构象（1β,2α半椅式）的平衡比例增加。这种耦合常数的系统性变化，是6α取代基存在并影响远程构象的“指纹”信号。本文展示了如何利用敏感的耦合常数作为探针，来检测和比较不同位置（如6α）取代基对甾体整体构象的立体电子效应。其逻辑是已知构型，研究其构象后果。

Ref：Kirk Marat, J. F. Templeton and V. P. Sashi Kumar. An NMR Study of A-Ring Conformation in Some 4-En-3-one Steroids. Magn. Reson. Chem., Vol. 25, 25-30 (1987).

文献三：基于反应立体选择性的合成导向判断（用于合成标记代谢物）

图7. 稳定氘代 6-羟基甾体

Furuta他们对6β-羟基皮质醇、6β-羟基可的松、6β-羟基睾酮（图7. 6位取代基为 β-羟基）的判断主要依赖已知具有立体选择性的化学反应，辅以色谱分离和质谱验证。他们的核心依据有：

1. 反应的立体选择性：采用紫外光催化的自氧化反应对3-乙基-3,5-二烯醇醚中间体进行C-6羟基化。该反应文献已知且本文验证主要生成6β-羟基产物（6β:6α ≈ 4:1）。选择性源于C-5,6双键平面化后，从空间位阻较小的β面进攻更有利。

2. 产物的分离与鉴定：通过制备薄层色谱（TLC）成功分离主要异构体（6β），并利用高分辨质谱（HR-ESI-MS）确认其分子量与目标6β-羟基化合物一致。

这个方法的判断逻辑是“以合成定构型”。利用一个机理明确、立体选择性已知的反应作为关键步骤，直接获得所需构型的产物。产物的构型由反应的立体选择性决定，后续分离和表征用于纯化和确认。

Ref：Takashi Furuta et al. Syntheses of stable isotope-labeled 6β-hydroxycortisol, 6β-hydroxycortisone, and 6β-hydroxytestosterone. Steroids 68 (2003) 693–703.

文献四：基于NOE效应的复杂天然产物结构鉴定

图8. 化合物Plancisides A-C的结构

Kicha和同事对目标化合物Plancisides A-C（图8）进行了合成和谱图分析（甾体母核6位取代基为α-羟基，其中C被硫酸化）。他们借助系统的2D NMR进行了结构解析，核心证据来自NOESY谱。如下：

1. 关键NOE相关：在NOESY谱中，明确观察到H-6与C-10角甲基质子（CH?-19）之间的空间相关峰。在5α-胆甾烷骨架中，C-10甲基（19-CH?）是固定的β取向。H-6与这个β取向的基团有显著NOE效应，证明H-6质子本身也处于β取向。因此，与C-6相连的羟基必须是α取向。

2. 完整的谱图归属：通过COSY, HSQC, HMBC等实验完整归属了甾体母核所有信号，确定了其属于已知的3β,4β,6α,8,15β,16β-六羟基取代模式。

他们的判断逻辑：“以空间距离定构型”。在复杂的天然产物结构鉴定中，NOE是确定相对构型最直接、最可靠的方法之一。通过观测关键质子间的空间接近性，可以直接推断出手性中心的相对构型。这是天然产物化学中结构解析的金标准之一。

Ref：Alla A. Kicha et al. Three New Steroid Biglycosides, Plancisides A, B, and C, from the Starfish Acanthaster planci. Nat. Prod. Commun. Vol. 9 (9) 2014, pp. 1269-1274.

丙酸酯氟替卡松EP杂质K的6位氯的朝向判断

我们2025年初对丙酸酯氟替卡松EP杂质K（F16347，结构见图9）做了合成开发。该杂质是丙酸酯氟替卡松6位氟原子被氯置换后形成的杂质，合成难度很大，文献鲜有合成报道，其成功合成为相关研发与质控提供了难得的关键对照品。这个杂质6位氯代的朝向，是一个很典型的如何判断6位取代基朝向的经典案例。结合上文总结的方法，我们对自己合成的丙酸酯氟替卡松EP杂质K的6-位氯原子的朝向进行了判断。

图9. 丙酸酯氟替卡松EP杂质K（F16347）

EP杂质K甾环编号

说明：COSY谱可以确定11位的羟基氢和所连次甲基的氢，有COSY相互作用信号，用紫色圆圈标出。故此排除附近信号后，找到6位氢，在5点多ppm。同时依照类似甾体结构图谱，找到18和19位的甲基位置，标示如上图。

说明：上图是NOE谱，可以看到6-H和19-甲基的相互作用。所以6-H处于β朝向，同位置的氯原子则处于α朝向，指向平面下方。

但是遗憾的是，想通过6-H和7-Hα/Hβ相互之间的耦合常数来进一步判断朝向是没有办法的。因为6-H基本就是一个单峰（图10），而7-Hα/Hβ的氢峰则和其他氢峰在1.8 ppm附近重叠在一起。所以得借助更高磁场强度的核磁检测仪器才行。

图10. 6H的核磁出峰

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